1. Romero H Melissa Y. Profesor de la asignatura Farmacología de la Facultad de Odontología de la Universidad de Carabobo.
   
   
2. Hernández Yrasema, Profesor asociado de la asignatura Microbiología de la Facultad de Odontología de la Universidad de Carabobo.
   
   
3. Gil Marielsa, Profesor de Bioanalisis en el laboratorio de bacteriología del Departamento de Microbiología de la facultad de ciencias de la salud de la Universidad de Carabobo.

Introducción
Las enfermedades de mayor prevalencia en la cavidad oral son las caries, gingivitis y periodontitis; estas si no se tratan adecuadamente, pueden ocasionar perdida de la unidad dentaria afectada, teniendo como consecuencia alteraciones: estéticas, digestivas, maloclusión dentaria, entre otras. Las Caries y Enfermedad Periodontal, tienen su origen en la existencia de una placa dentobacteriana previa o biopelícula de la placa, definida según la Organización Mundial de la Salud (OMS) como una entidad bacteriana proliferante con actividad enzimática que se adhiere firmemente a las superficies dentarias y que por su actividad bioquímica y metabólica ha sido propuesta como el agente etiológico principal en el desarrollo de la caries dental. (1) El Streptococcus mutans miembro del Grupo Viridans, se considera como la especie más frecuentemente aislada en la placa dentobacteriana. (1-6) Por consiguiente, el hecho de reconocer a Streptococcus mutans como el microorganismo más importante en la iniciación de la caries, conduce a diseñar medidas de prevención dirigidas hacia la eliminación o disminución de éste, en la cavidad oral. Al respecto, se han planteado diferentes estrategias: Control inmunológico, control microbiológico, educación sanitaria, control de la dieta, detección previa de factores de riesgo, higiene bucodental, ingestión y aplicación de fluoruros, aplicación de sellantes de puntos y fisuras, ingestión y aplicación de fármacos. (7-9) En tal sentido, el uso de antimicrobianos y antisépticos, principalmente de uso tópico o local se ha utilizado conjuntamente con las técnicas de cepillado para lograr la eliminación de la placa dentobacteriana. Sin embargo el uso de antimicrobianos en el control de placa no tiene sentido, por los problemas sensibilización planteados en el hospedador, multitud de efectos secundarios y el ir creando de forma progresiva un mundo bacteriano plagado de cepas resistentes(5). Cabe destacar, que los Streptococcus del grupo Viridans también son la causa principal de la Endocarditis bacteriana subaguda y al ser Streptococcus mutans miembro importante de este grupo dado que se encuentran en grandes cantidades 1010/g en la biopelícula de la placa, luego de una cirugía dental o cualquier procedimiento odontológico donde se lesione mucosa bucal pueden vehiculizarse en sangre y viajar hasta las válvulas cardiacas, siempre y cuando existan causas favorecedoras como por ejemplo, un daño previo valvular en pacientes que han sufrido fiebre reumática.(10)Por otro lado, es oportuno mencionar que, entre las más antiguas actividades del ser humano está el estudio de plantas, en particular como fuentes de alimento. Siempre, el hombre se vio en la necesidad de hacer la distinción entre aquellas plantas que eran venenosas y las que no lo eran, adquiriendo así un amplio conocimiento sobre aquellas que poseían propiedades medicinales, que fue transmitiendo a través del tiempo al principio en forma verbal y luego por medio de la escritura. Sin duda alguna, en el reino vegetal existen muchas especies de plantas que contienen sustancias de gran importancia para la medicina y que aún están por descubrir. Muchas especies son estudiadas con frecuencia para hallar en ellas su posible valor farmacológico, en especial por sus propiedades estrogénicas, antipiréticas, antihelmínticas, astringentes, fungicidas, antibióticas. (11,12). Actualmente, las plantas medicinales están recuperando parte del protagonismo que tuvieron en los primeros tratamientos médicos, se percibe un nuevo auge de las aplicaciones terapéuticas de las plantas, una recuperación de su uso. La eficacia de algunos principios activos de origen natural ha quedado demostrada, como es el caso de la acción vasodilatadora del Ginkgo biloba y las propiedades antidepresivas de la conocida como hierba de San Juan o Hypericum (13). La medicina natural aunque ha sido utilizada como tratamiento medico general desde hace muchos años, es muy poco conocida como posible aporte al ámbito Odontológico. Al respecto, existen investigaciones para estudiar el comportamiento de ciertos compuestos de origen vegetal sobre la bacteria Streptococcus mutans, entre las que se pueden señalar las realizadas con aceite esencial de Melaleuca alternifolia "Te verde" (14,15); extracto de Anacardium occidentale L. "Merey"s y con la Matricaria recutita "Manzanilla alemana" como irrigante endodóntico,(16); varios aceites esenciales solos y/o combinados con la clorhexidina sobre cultivos bacterianos,(17) Con el aceite esencial de la Matricaria recutita "Manzanilla" ocurre algo similar, sus múltiples beneficios médicos son bien conocidos pero su posible uso como bacteriostático de la principal bacteria implicada en la formación de placa dentobacteriana, no reúne mayores referencias; he allí donde se pretende consolidar este aporte a la investigación y por ende al medio Odontológico. Dada la escasez de investigaciones científicas en el área temática, fortalece el valor del trabajo propuesto. De esta manera, la presente investigación podrá brindar una alternativa de elección en la inhibición de placa dentobacteriana y por consiguiente una alternativa en la prevención y tratamiento de las patologías mas frecuentes de la cavidad bucal y contribuir en la profilaxis de la Endocarditis subaguda infecciosa. De todo lo anteriormente señalado y tomando en consideración el uso popular que se le ha dado a Matricaria recutita, "Manzanilla Alemana" cuyos enjuagues le han atribuido propiedades antiflamatorias y antisépticas,(18,19); surge la siguiente interrogante. ¿La Matricaria recutita tendrá acción inhibitoria( bacteriostática) sobre los Streptococcus mutans?


Objetivo general
Determinar la actividad bacteriostática del aceite esencial de la Matricaria recutita "Manzanilla Alemana" sobre las cepas liofilizadas números: 656,659 y 660 de Streptococcus mutans a través de un estudio in Vitro.

Objetivos específicos

1. Establecer la curva de crecimiento de las Cepas Tipo Liofilizada números: 656,659 y 660 de Streptococcus mutans bajo condiciones normales de pH, temperatura y medios de cultivos seleccionados.
   
   
2. Describir el crecimiento de las Cepas Tipo Liofilizada Número: 656,659 y 660 de Streptococcus mutans a diferentes concentraciones de aceite esencial de Matricaria recutita "Manzanilla Alemana" bajo condiciones normales pH, temperatura y medios de cultivos seleccionados.
   
   
3. Determinar la concentración mínima inhibitoria del aceite esencial de Matricaria recutita al sobre las cepas 656,659 y 660 de Streptococcus mutans.
   
   
4. Medir el halo de inhibición de crecimiento bacteriano "in Vitro" de las cepas 656,659 y 660 de Streptococcus mutans en los discos a diferentes concentraciones del aceite esencial de Matricaria recutita "Manzanilla Alemana"

Metodología
La presente investigación atendiendo a los objetivos planteados tuvo un enfoque descriptivo-exploratorio y un diseño longitudinal no experimental, en base a un estudio de campo, muestra la unidad de análisis estuvo representada por tres cepas Tipo liofilizada Nº CVCM 656 (ATCC 25175) Lote TE 27-10-05; CVCM 659 (OD-4 CJ) Lote 16-07-98;NCTC10449, CVCM 660 (0D-5 LMT) Lote 13-02-01 de Streptococcus mutans proporcionadas por el Centro Venezolano de Colecciones de Microorganismos, de la Facultad de Ciencias de la Universidad Central de Venezuela.

Instrumentos y técnicas de recolección de datos
Fue la observación directa con el uso de una regla milimetrada para la medición del halo de inhibición, Espectrofotómetro marca Star Fax 3000 para la medición de la medida de absorbancia, además de un registro de observación , donde se asentaron los datos suministrados resultados de la experiencia de laboratorio.

Procedimiento de la investigación
Aceite Esencial: Para la experiencia de laboratorio se utilizó Aceite esencial estandarizado de Matricaria recutita "manzanilla alemana" fabricado en España .por el Laboratorio Aspara Vital con registro sanitario N° 1658, cuyos datos de composición según resultado de la cromatografía de gases suministrada por el proveedor es el siguiente: Beta Farnesene: 17,40 %,Oxyde Bisabolol ?: 4,85 %,Oxyde Bisabolone: 4,81 %,Chamazulene: 3,15 %,Oxyde Bisabolol ?: 40%.

Recuperación de la viabilidad de las cepas: Antes de comenzar con el experimento se rehidrataron las cepas liofilizadas en caldo Braim Heart Ihfusion BHI De Himedia Laboratories CA. Se incubaron en estufa a 36°c, por 24 horas en microaerofília para su reproducción. Se repicó cada cepa en una placa de agar sangre y se realizó coloración de Gram para constatar su pureza, finalmente, por cada cepa se preparó una suspensión bacteriana al 0.5 Mc Farland. Para medir si las cepas se reproducían en el tiempo se realizaron lecturas de absorbancia a 625 de longitud de onda a las 4, 8, 18 y a las 24 horas de incubación. La medida de absorbancia obtenida es directamente proporcional a la concentración de los microorganismos presentes. Las lecturas se realizaron en un equipo de medición de absorbancia Marca Start Fax. Para ello se colocó las distintas cepas a las horas indicadas en los pocillos de lectura. Para poder correlacionar la medida de absorbancia con la concentración de microorganismos se utilizó un patrón 0.5 Mac Farland que representa una concentración conocida de microorganismos la cual es de 1.5 x 108 UFC. En las lecturas se incluyó un pozo blanco la cual contiene caldo BHI virgen, esta lectura debe ser restada a las lecturas realizadas para eliminar la absorbancia procedente del caldo BHI.

Concentración Mínima Inhibitoria del aceite esencial de Matricaria recutita. La determinación de concentración mínima inhibitoria se realizó por dos métodos: microdilución y por difusión en discos. Dado al costo y a la difícil consecución del aceite esencial de Matricaria recutita se prefirió el método de Micro dilución, ya que permitía un mayor numero de experiencias usando pequeños volúmenes del aceite esencial a probar. En vista de la insolubilidad del aceite esencial en agua, se requirió de un agente emulsionante que permitiera durante la prueba el contacto del microorganismo con el aceite esencial, para ello se usó aceite de maíz comestible puro (13.4 % ácidos grasos saturados y 86.6% ácidos grasos insaturados).

El método de micro dilución: requiere una placa plástica con 96 receptáculos o pozos, distribuidos en 12 columnas y 6 filas. Por cada cepa bacteriana usada se utilizó una fila de 12 pozos procediéndose de la siguiente manera: Del pozo número 2 hasta el pozo número 11 se dispensó 100 ul del diluente, en este caso se utilizó: Aceite puro de maíz, luego se colocó 100 ul del aceite esencial de Matricaria recutita. al primero, segundo y onceavo pozo, a partir del segundo pozo se mezcló varias veces succionando con la micro pipeta repetidamente a fin de asegurar una completa homogeneidad de la mezcla de las dos sustancias (aceite esencial y diluyente) para después transferir 100 ul del pozo numero dos (correspondiente a la dilución ½) , al siguiente (numero tres) repitiendo la operación hasta llegar al pozo número nueve (Correspondiente a la dilución 1/256) descartando los últimos 100 ul de esta dilución, posteriormente se dispensó desde el tubo 1 al 10 25 ?l de la suspensión bacteriana al 0,5 Mc Farland. Finalmente el pozo número 12 contiene 100 ul de caldo BHI. De esta manera cada hilera compuesta por pozo 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 Correspondiente de la siguiente manera: Aceite puro de Matricaria recutita, Dilución 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64, 1/128, 1/256, control positivo, control negativo y control de esterilidad). Luego se cubrió cada hilera con cinta transparente y se mantuvo a temperatura ambiente por 24 horas.

Evaluación de la actividad bacteriostática: Al término de la incubación se traspasó 0,01 ml de cada pozo a placas de Agar Sangre utilizando un asa calibrada para ello, realizando la técnica de sembrado por agotamiento, posteriormente se incubó durante 24 a 48 horas a 37 ºC, al termino de este tiempo se analizó cada placa para observar si había o no crecimiento del microorganismo.

Procedimientos de Control de Calidad: El pozo 10 representó el control positivo en el que se verifica que el microorganismo era viable y capaz de reproducirse en placas de agar sangre y en caldo BHI, aún cuando había sido incubado con el diluente utilizado (aceite de maíz), evidenciando que el diluente por sí solo no tiene efecto bactericida ni bacteriostático sobre el microorganismo en estudio.

El pozo 11 representó el control negativo el contenía diluente (aceite de maíz) y el aceite esencial de Matricaria recutita, el cual garantizó que ambas sustancias estaban libre de microorganismos, es decir estériles. El pozo 12 representó el control de esterilidad de la placa de microdilución, la cual contenía caldo (BHI) utilizado en la dilución, el cual durante el experimento permaneció transparente, indicando que la placa estaba estéril y que no hubo contaminación externa.

En la evaluación de la actividad bacteriostática y bactericida: En los medios que se observó crecimiento se verificó que se tratara del microorganismo empleado realizando coloración de Gram y la respectiva observación al microscopio para observar la morfología y la pureza de las cepas bacterianas en investigación.

Método de difusión: Se procedió a preparar el medio de cultivo Agar de Müller-Hinton en placas de Petri con el añadido de sangre de cordero para enriquecer el medio y asegurar la reproducción de Streptococcus mutans, quien es considerado un microorganismo difícil de crecer; se procedió a realizar la siembra por diseminación de superficie de las cepas 656,659 y 660 de Streptococcus mutans, en tres placas cada cepa, se dejaron secar entre 3 y 5 minutos y se procedió a colocar discos de papel de filtro Whatman N° 1 de 6 mm estériles embebidos en 10 ul del aceite esencial de la Matricaria recutita puro y a las concentraciones estudiadas, colocando tres discos de diferentes concentraciones en cada placa con la cepa estudiada. Se incubaron en un ambiente de microaerofilia y se observaron a las 12 horas, 24 horas y 48 horas, seguidamente se procedió a verificar la existencia del halo de inhibición bacteriana alrededor del disco y se procedió a medir el diámetro de inhibición bacteriana con una regla milimetrada.

Técnicas de análisis: De acuerdo con el tipo de investigación planteada, una vez recopilado los datos, se procedió al Análisis Estadístico, se aplicaron pruebas no paramétricas para establecer la significación estadística (test de Kruskal Wallis y la prueba de Chi cuadrado).

Resultados: A continuación se presentan los resultados obtenidos de la presente investigación. La información se presenta en cuadros de asociación, con frecuencias absolutas, porcentajes de los diferentes resultados obtenidos en los cultivos realizados en el laboratorio para las tres cepas investigadas. Dadas las características de los datos, se aplicaron pruebas no paramétrica para establecer la significación estadística de las diferencias en el crecimiento de las tres cepas Streptococcus mutan, a través de sus medidas de absorbancia, de la distribución del Halo de Inhibición de crecimiento bacteriano, así como la capacidad bactericida de diluciones del aceite esencial de Matricaria recutita sobre tres cepas liofilizadas de Streptococcus Mutans en diferentes medios de cultivos y unidades de tiempo.

Fue calculado el porcentaje de resultados negativos en cuanto al número de diluciones efectuadas en los dos medios de cultivos y en los tiempos de los mismos. También se obtuvo el promedio del Halo de Inhibición considerando las nueves diluciones experimentadas para el cultivo de las tres cepas.

La presentación está constituida por dos tablas y una gráfica, en las que se pretenden con la información en ellas reseñada cumplir satisfactoriamente con los objetivos propuestos en la investigación.

Con relación al objetivo especifico número uno, el cual expresa: Establecer la curva de crecimiento de las Cepas Tipo Liofilizada 656, 659, y 660 de Streptococcus mutans bajo condiciones normales de pH, temperatura y medios de cultivos seleccionados.

En el Gráfico N° 1, se puede ver claramente el crecimiento bacteriano de las cepas de Streptococcus mutans, en términos de absorbancia en diferentes períodos de incubación. La tendencia que se observa es la misma para las tres cepas, destacándose que la cepa N° 659 tuvo los mayores valores para cualquier tiempo de incubación, seguida de la cepa N° 656. Cabe destacar que a las cuatro horas, la cepa N° 656 tuvo un mayor crecimiento (0,021) que la N° 659 (0,004), pero ya las ocho horas la tendencia se revierte, siendo además en los períodos de 1 y 24 horas el crecimiento de la cepa N° 659 por encima de la N° 659, pero menor, como se dijo de la cepa N° 660.

Al evaluar el crecimiento bacteriano, según el tiempo de observación, se demuestra que hubo un crecimiento significativo para cualquiera de las tres cepas, dado el valor conseguido del test de Kruskal Wallis, que fue igual a un valor de Chi cuadrado de 10,385 con tres grados de libertad para una significación menor al 5% (P < 0,016).
En cuanto a la diferencia de las distribuciones del crecimiento bacteriano según las cepas, se determinó mediante el test de Kruskal Wallis, que no hay diferencias entre las tres cepas, puesto que el valor de Chi cuadrado fue de 0,038 para dos grados de libertad y una significación mayor al 5% (P < 0,981).

Al analizar las medidas obtenidas se puede observar un periodo escasa reproducción bacteriana entre las 4 y ocho horas, y a partir de ese momento comienza una fase logarítmica de crecimiento bacteriano, representada por una línea ascendente en la curva de crecimiento, después de las 18 horas aunque sigue habiendo crecimiento éste disminuye significativamente, tornándose estacionario el crecimiento bacteriano.

Con relación al objetivo especifico número dos, el cual expresa Determinar el crecimiento de las Cepas Tipo Liofilizada Número: 656, 659,660 de Streptococcus mutans a diferentes concentraciones de aceite esencial de Matricaria recutita "Manzanilla Alemana" bajo condiciones normales de: pH, temperatura y medios de cultivos seleccionados.

En la Tabla N° 1 se puede apreciar que las tres cepas de Streptococcus mutan dieron resultados negativos a las 24 horas de observación en los cultivos de Placas de Agar Sangre, sea cual fuere la dilución del aceite esencial de Matricaria recutita, puesto que el porcentaje de resultados negativos en función del número de diluciones (9) fue en las tres cepas igual al 100%.

En el medio de cultivo de Tubos con Caldos de BHI, para el mismo período de incubación (24 horas), ocurrió algo similar para cualquier dilución del aceite, pero sólo para la cepa N° 656, donde el porcentaje fue del 100%. Para la cepa N° 659 los cultivos en Tubos de Caldos BIH fueron negativos sólo sin diluir el aceite esencial y en dilución 1 /2 para un 22,2% y en la cepa N° 660 fueron negativos los cultivos para el mismo período de observación y medio de cultivo en el aceite esencial sin diluir y en las diluciones 1 / 2, 1 / 4 y en 1 / 8, dando negatividad en el 44,4% de las diluciones realizadas.

Al esperar 48 horas para ver los resultados de los cultivos, sucedió que tanto en los medios de cultivo Agar Sangre y Caldos de BHI, las tres cepas arrojaron resultados negativos, es decir ausencia de crecimiento bacteriano sólo para el aceite esencial sin diluir, por lo que la negatividad expresada porcentualmente fue igual para todas estas situaciones experimentales del 11,1%.

Con relación al objetivo número tres: Determinar la concentración mínima inhibitoria del aceite esencial de Matricaria recutita sobre las cepas 656,659 y 660 de Streptococcus mutans, según los resultados obtenidos se observó acción bactericida en el tubo y placa con aceite puro sin diluir y bacteriostática en la dilución 1/2 (tabla nº 1)

Con relación al objetivo especifico número cuatro, el cual expresa Medir el halo de inhibición de crecimiento bacteriano "in Vitro" de las cepas 656,659 y 660 de Streptococcus mutans en los discos a diferentes concentraciones del aceite esencial de Matricaria recutita "Manzanilla Alemana"

Los valores del tamaño del Halo de Inhibición observados en los medios de cultivos con las cepas números 656, 659 y 660 para el aceite sin diluir fueron de 11, 8 y 12 milímetros respectivamente, mientras que para una dilución de 1 / 2 , del aceite esencial de Matricaria recutita los valores en el mismo orden resultaron tener 8, 5 y 9 milímetros. Como se aprecia, con la dilución a 1 / 2 el halo disminuye en 3 milímetros en cada cepa. Al obtener los valores medios del halo de Inhibición considerando todas las medidas de dilución, fueron para la cepa nº 656 de 2,1 milímetros, para la cepa N° 659 de 1,4 milímetros y para la cepa N° 660 de 2,3 milímetros. Dado la distribución de los resultados de la medición de Halo de Inhibición, que no se asemejan a la distribución normal, se empleó el test de Kruskal Wallis para conocer si las distribuciones difieren entre sí según la cepa investigada, el resultado obtenido al aplicar este test da un valor de Chi cuadrado igual a 0,072, con dos grados de libertad y una significación mayor del 5% (P < 0,965), por lo que se demuestra no hay diferencias significativas en las distribución del tamaño del Halo de Inhibición entre las tres cepas.

Discusión La investigación de fármacos capaces de eliminar la placa dental cariógena tiene muchas décadas. Un agente antiplaca debe tener unas propiedades importantes como disminuir significativamente el biofilm, evitar generar cepas resistentes, no manchar los dientes, mantener inalterable el sentido del gusto, es decir ser inocuo sobre los tejidos bucales. Sin embargo, no existe en la actualidad un producto comercial que reúna todas esas propiedades y que no genere efectos secundarios o falta efectividad en el control del biofilm (20) Es por lo que en los últimos años han ido en aumento el estudio de efectividad de productos naturales como: Camellia sinensis (21,22), Anacardium occidentale L (15), Punica granatun (23) en el control de la placa dentobacteriana y en especial con efecto bactericida o bacteriostático sobre el Streptococcus mutans.El presente estudio, con tres cepas bacterianas del Streptococcus mutans demostraron ser susceptibles a la acción del aceite esencial de Matricaria recutita, proporcionalmente a la concentración del mismo, observándose una disminución en el diámetro de inhibición en la medida que disminuía la concentración del aceite, tal como se observa en la tabla nº 2. Estos resultados discrepan con lo reportado por González (24) quien informa no haber observado halo de inhibición alrededor de los discos impregnados con este aceite esencial. Sin embargo, si se toma en consideración el método de Aromatograma de Duraffourd descrito por Alzamora (25) y se aplica a los resultados arrojados en el presente estudio, las cepas bacterianas 656 y 660 mostraron una sensibilidad tipificada "limite" dado a que la medida del halo estuvo entre 9 y 14 mm. Las diferencias reportadas entre los halos exhibidos por las tres cepas bacterianas que pertenecen al mismo genero y especie, se atribuye a diferencias genéticas entre ellas.Igualmente al realizar la experiencia con el método de microdilución se pudo constatar por ausencia de crecimiento bacteriano en el medio de cultivo, y realización de Gram, el efecto bactericida en el aceite puro sin diluir. Observándose también, efecto bacteriostático en la dilucion1/2, es decir al 50% (ver tabla n° 1) este resultado coincide con las investigaciones realizadas por otros autores (18,19 ) quienes también reportaron efecto bacteriostático sobre el Streptococcus mutans por parte de Matricaria recutita utilizada en enjuagues o formando parte de la composición de una crema dental.

El efecto antiséptico y antiinfeccioso de la Matricaria recutita viene dado por la presencia de derivados terpénicos como: matricina, camazuleno, a-bisabolol y los óxidos a y b del ?-bisabolol (26) y el principal mecanismo de acción antibacteriano es la disrupción de la membrana celular bacteriana, mediante tres posibles vías: Aumentando su permeabilidad a pequeños iones, afectando la estabilidad estructural y desestabilizando el empaquetamiento de la bicapa lipídica, produciendo la muerte del Streptococcus mutans.(27). Es importante mencionar el inconveniente que se presenta con la escasa solubilidad acuosa del aceite esencial de Matricaria recutita, dado a que se convierte en un verdadero desafío a la hora de realizar las diluciones seriadas para obtener la concentración mínima Bactericida y la concentración mínima Inhibitoria, por lo cual se sugiere realizar este trabajo con infusiones de Matricaria recutita, lo cual facilitaría la realización de estudios"in Vitro" e "in Vivo" y así comparar los resultados obtenidos con el Aceite Esencial.