Efecto del Diclofenaco en la formación de osteoclastos inducidos por estrés mecánico

  • M. en C. ELSA CALLEJA QUEVEDO
    Profesora Asociada de tiempo completo. FES Iztacala UNAM.
    Profesora del curso de Histología.

  • C.D. GARCÍA HERNÁNDEZ ANA LILIA
    Ayudante de profesor FES Iztacala UNAM.
    Clínica de Odontología Integral

  • M. O. JOSÉ FRANCISCO GÓMEZ CLAVEL
    Profesor Asociado de tiempo completo FES Iztacala UNAM
    Profesor de la Especialización en Ortodoncia
Resumen
Las prostaglandinas (PGs) estimulan la resorción ósea, aunque los resultados de los trabajos que estudian las PGs son contradictorios. Se han usado los AINEs indometacina, aspirina y rofecoxib para inhibir la población de osteoclastos. El objetivo de este trabajo es probar el efecto del Diclofenaco en la población de osteoclastos de ratas sometidas a estrés mecánico ortodóncico.

A 30 ratas se les colocó entre los primeros y segundos molares maxilares un resorte en U de níquel-titanio de 0.012 pulgadas de grosor y activado con una fuerza de 30g, a 15 de ellas se les administró diclofenaco a dosis de 2mg/kg de peso cada 12 horas. A 5 ratas testigo, no se les dio ningún tratamiento. Los animales se sacrificaron a las 24, 48 y 72 horas después de la colocación del resorte, se les disecó el maxilar que se descalcificó con EDTA, se incluyeron en parafina para obtener cortes seriados de 6 micrómetros que se tiñeron con H y E.

Resultados: En el grupo testigo (sin tratamiento), no se observaron osteoclastos. En el grupo testigo sometido a estrés mecánico, el número de osteoclastos aumentó gradualmente a las 24 hrs. 6.41(±.8238) osteoclastos, a las 48 hrs. 9.63(±.8264) y a las 72 hrs. 14.4(±.8039). El Diclofenaco, a las 24 horas bloqueo la formación de osteoclastos 2.47(±.4056), a las 48 hrs. 1.88(±1.0081) y a las 72 hrs. 1.45(±.8810).

El diclofenaco al igual que otros AINEs inhibe la formación de osteoclastos en el modelo de resorción ósea inducida por fuerzas ortodóncicas.

Palabras clave: diclofenaco, osteoclastos, estrés ortodoncico


Abstract
The prostaglandins estimulate bone resorption. Some studies show that effects of prostaglandins are contradictory. NSAID indometacin, aspirin and refecoxib have been used for inhibit the osteoclast population. The goal of this work was evaluate the effect of diclofenac in the osteoclast´s population in rats under orthodontical stress.

Thirty Wistar males rats of 250 + / - 25 g of weight was used. A uniform standardized U spring, made of 0.012-inch nickel-titanium wire was set in each animal mouth between the right and left upper first molar, they were divided into 2 groups of 15 rats, one of them were inyected with diclofenac in dosis of 2mg/kg each 12 hours The animals were killed at 24, 48 and 72 hours after the placement of the appliances. Five more rats were used as control with no drug and no mechanical stress.

The maxillae was removed and fixed in formaldehyde 48 hours, descalcified in EDTA (pH 7.4) and then processed by histologic routine technic, and included in Parafine. Serial sections of 6 ?m were cut and stained with hematoxylin and eosin, Results: the NSAIDs diclofenac in all doses inhibited the formation of osteoclasts. In control group, osteoclasts increase gradually at 24, 48 and 72 hours. The group of witness to which nothing was applied there were no osteoclasts observed. In the witness group sumitted to mechanical stress the number of osteoclsts was gradually increased at 24 hours 6.41 (±.8238) osteoclasts, at 48 hours 9.63 (±.8264) osteoclasts, at 72 hours 14.4 (±.8039) osteoclast.

Key words: diclofenac, osteoclast, orthodontic stress

Resumo:
Os prostaglandins (PGs) estimulam o resorción ósseo, embora os resultados dos trabalhos que estudam o PGs sejam contraditórios. Foram usados o indometacina AINEs, aspirina e rofecoxib para inibir a população dos osteoclastos. O objetivo deste trabalho é provar o efeito do Diclofenaco na população dos osteoclastos do ratos sometidas dos stress ortodóncico mecânico.

A 30 ratos os molares foram colocados a eles entre o primeiro e a os segundos meios dos maxilares ou de um niquel-titânio de 0.012 polegadas no ativado espessura e com uma força de 30g, a 15 deles o diclofenaco ao dose de 2mg/ foi-lhe administrado quilograma do peso cada 12 horas. À testemunha de 5 ratos, nenhum tratamento não ocorreu eles. Os animais sacrificaram-se a 24, 48 e 72 horas depois que posicionar dos meios, maxilar disecado a eles que ele descalcificado com EDTA, foram incluídos na parafina para obter cortes dos seriados de 6micrômetros que foram tingidos com H e E. Resultados: Na testemunha do grupo (sem tratamento), os osteoclastos não foram observados. No stress mecânico submissive da testemunha do grupo, o número osteoclastos aumentou gradualmente a 24 horas. 6.41(±.8238) osteoclastos, a 48 horas. 9.63(±.8264) e a 72 horas. 14.4(±.8039). O Diclofenaco, às 24 horas blockade a formação dos osteoclastos 2.47(±.4056), a 48 horas. 1.88(±1.0081) e a 72 horas. 1.45(±.8810). O diclofenaco como o outro AINEs inibe a formação de osteoclastos no modelo do resorción ósseo induzido por forças ortodóncicas.

Palavras chaves: diclofenaco, osteoclastos, stress ortodoncico


Introducción
La mayoría de los autores concuerdan en que las prostaglandinas (PGs) juegan un papel importante en la resorción ósea inducida por estrés mecánico ortodóncico.1,2 Su síntesis y secreción es inducida por las citocinas mediadoras del proceso inflamatorio.3

Sin embargo los resultados de los trabajos que estudian a las prostaglandinas (PGs) son contradictorios. En cultivos de osteoblastos las PGs estimulan la formación de nódulos de mineralización.4 En contraste, las PGs son potentes estimuladores de la resorción ósea y de la formación de osteoclastos en cultivo de órganos, en particular las prostaglandinas E1, E2 y la prostaciclina.5 También promueven la formación de células parecidas a osteoclastos en cultivos de médula ósea murina.4 La interleucina 1 así como la presión hidrostática intermitente negativa (-30g/cm2) o positiva (+30g/cm2), estimularon la producción de prostaglandinas y de factores estimuladores de la reabsorción ósea en el medio condicionado producido por fibroblastos de ligamento periodontal humano, el cual indujo la formación de osteoclastos, en cultivos de médula ósea. La PGE2 colocada directamente a los cultivos de médula ósea indujo la formación de osteoclastos y este efecto no aumentó por la presencia de medio condicionado o la presión hidrostática. Stein y col. encontraron que la inyección de PGE en los dientes anteriores de ratas induce la resorción ósea en ausencia de inflamación.2

Un método alternativo para demostrar el papel de las PGs en la resorción ósea inducida por el estrés mecánico ortodóncico es el uso de inhibidores de la cicloxigenasa o antiinflamatorios no esteroideos (AINEs). Chambers y cols., reportaron en conejos tratados con indometacina disminución en el número de osteoclastos pero no en el grado de movimiento dental.8 Los mismos resultados obtuvieron Mohammed y col en ratas7 y Chumbley y Tuncay en gatos9. Yamasaki y col., trabajando con ratas a las que les colocó una pieza de banda elástica entre el primer y segundo molar superior derecho encontraron que la acción de la indometacina era más efectiva si se administraba una hora antes del tratamiento y tenía muy poco efecto supresor en la aparición de osteoclastos, cuando se administraba a las 24 y a las 48 hrs. después del tratamiento.1 Usando ácido acetilsalicílico se ha encontrado disminución del número de osteoclastos pero no del grado de movimiento dental.10 Sari y col. compararon el efecto de la aspirina y el rofecoxib durante el movimiento ortodóncico en humanos, midiendo los niveles de PGs en el fluido crevicular, y encontraron que la aspirina inhibe en mayor grado la expresión de PGs que el rofecoxib.11

El Diclofenaco es un potente, inhibidor de la COX1 y COX2, y por lo tanto de la síntesis de PGs y tromboxano. Nobukamawa y col. inhibieron la osteoclastogénesis en cultivos de médula ósea, de manera dosis dependiente12. El diclofenaco, disminuye la producción de leucotrienos, estimulando la reincorporación del ácido araquidónico libre a triglicéridos.13 Inhibe la liberación de radicales libres oxigenados que participan en el daño tisular.14 Tiene además acción inhibitoria sobre la migración leucocitaria, y la actividad de la catepsina 1, disminuyendo la degradación del cartílago articular.15 Hay evidencias de que el diclofenaco al igual que otros AINES que inhiben fuertemente la síntesis de Prostaglandinas, como el ibuprofeno y la indometacina, retrasan la reparación de los tejidos lesionados16 y en el hueso interfieren no sólo con la reparación si no también con el crecimiento17.

No se ha estudiado el efecto del diclofenaco sobre la población de osteoclastos durante el estrés mecánico in vivo.

El objetivo de este trabajo es probar el efecto del diclofenaco en la población de osteoclastos en ratas sometidas a estrés mecánico ortodóncico.


Material y métodos
Se utilizaron 35 ratas wistar machos de 250+/- 20 g que fueron mantenidas en condiciones de bioterio y alimentadas ad libitum. A 30 ratas, previa anestesia con pentobarbital sódico (1.5 ml por kg de peso) se les colocó un resorte en forma de U elaborado con alambre de níquel-titanio de 0.012 pulgadas de grosor y activado con una fuerza de 10 g, colocado entre los primeros y segundos molares maxilares de acuerdo a la técnica descrita por Igarachi19, y se les distribuyo en los siguientes grupos de animales:

GRUPO 0. Testigos (T0) a 5 ratas a las que no se les aplicó tratamiento ortodóncico ni se les administró ningún medicamento.

GRUPO 1.Testigos (TM) 15 ratas a las que no se les administró ningún fármaco, solamente solución salina y la colocación del aparato ortodóncico y que en grupos de 5 fueron sacrificadas a las 24, 48 y 78 hrs. después de la colocación de los aparatos ortodóncicos.

GRUPO 2. 15 ratas a las que se les administró diclofenaco por vía subcutánea en dosis de 2 mg/Kg de peso cada 12 horas y que en grupos de 5 fueron sacrificadas a las 24, 48 y 78 hrs. después de la colocación de los aparatos ortodóncicos.

Los animales de los se sacrificaron por sedación y decapitación.

Una vez sacrificados los animales se les disecó el maxilar superior y se fijó en paraformaldehído en buffer de fosfatos durante 48 horas, posteriormente se descalcificó con ácido etilendiaminotetracético (EDTA) a pH 7.4 durante 28 días o hasta que radiográficamente no se observaron zonas de calcificación. A todos los maxilares se les deshidrató en alcoholes crecientes para incluirse en parafina y obtener cortes seriados de 6 micras que fueron teñidos con Hematoxilina y Eosina.

El examen histológico se enfocó al septum intrarradicular de las raíces vestibulares de los primeros molares, con el propósito de valorar el grado de reabsorción ósea, se contó el número de osteoclastos en un área de 400 por 800 micras de cada cinco cortes de intervalo.


Resultados
En el grupo T0 no se observaron osteoclastos, en el grupo TM a las 24 hrs. la media de osteclastos fue de =6.41 (±.8238) (Figura 1), a las 48 hrs. 9.63 (±.8264) y a las 72 hrs. 14.4 (±.8039).

TESTIGO CON ESTRÉS MECANICO A LAS 24 HRS.
Figura 1.Técnica H y E. Testigo con estrés mecánico a las 24 hrs. Donde reobservan gran cantidad de osteoclastos adheridos al hueso en el espacio medular adyecente ( O: osteoclastos, C:cemento, D: dentina, H.A.: Hueso alveolar)


En los grupos experimentales a las 24 hrs. la media fue de 2.47 (±.4056) osteoclastos (Figura 2), a las 48 hrs. de 1.88 (±1.0081) (Figura 3) y a las 72 hrs de 1.45 (±.8810) (Figura 4).


EXPERIMENTAL DICLOFENACO 24 HRS.
Figura 2 Técnica H y E. Experimental diclofenaco a las 24 hrs. donde se observan osteoclastos adheridos al hueso en el espacio medular adyacente ( O: osteoclastos; H.A.: hueso alveolar)

EXPERIMENTAL DICLOFENACO 48 HRS
Figura 3. Técnica H y E. Experimental diclofenaco a las 48 hrs. donde se observan osteoclastos adheridos al hueso en el espacio medular adyacente ( O: osteoclastos; H.A.: hueso alveolar)

EXPERIMENTAL DICLOFENACO 72 HRS.
Figura 4. Técnica H y E. Experimental diclofenaco a las 72 hrs. donde se observan osteoclastos adheridos al hueso en el espacio medular adyacente ( O: osteoclastos; H.A.: hueso alveolar)

Figura 5 Gráfica de el número de osteoclastos presentes en la zona interradicular del primer molar maxilar en los diferentes grupos


Discusión
Aunque la remodelación ósea es un fenómeno que ha sido muy estudiado no se conocen completamente los mecanismos moleculares que la regulan. En el caso de la remodelación inducida por fuerzas ortodóncicas, aunque se desconoce cuales son todas las moléculas implicadas y cuál es la secuencia exacta de los eventos,18 la mayoría de los autores concuerdan en el papel principal que juegan las PGs en la inducción de la activación de los mecanismos moleculares que culminan con la diferenciación de las células implicadas en la resorción ósea.1,2

Se sabe que la presión ejercida en los tejidos al aplicar fuerzas ortodóncicas producen una reacción semejante a la inflamación con la consiguiente reactividad vascular y celular que conducen a la síntesis de moléculas señal, entre ellas las citocinas que inducen la síntesis de PGs.2 También se ha postulado que las PGs se sintetizan durante el estrés mecánico ortodóncico porque es probable que los osteoblastos posean receptores acoplados a la proteína G que detectan las fuerzas mecánicas y como resultado de este estímulo se favorece la activación de la fosfolipasa A, que es la enzima responsable de la síntesis del ácido araquídónico, el metabolito precursor de las PGs y leucotrienos.18

La síntesis de PGs provoca una cascada de reacciones que finalmente estimula a los osteoblastos a inducir a los precursores mononucleares de los osteoclastos a diferenciarse como células polinucleadas.Se sabe que el diclofenaco evita la osteoporosis en las mujeres postmenopaúsicas, Nobukawa y col13 sugieren que esto se debe a que actúan directamente sobre los precursores de los osteoclastos Se han encontrado evidencias de que las PGs estimulan en las células mononucleares la expresión del receptor de RANKL y de la osteoprotegerina, péptidos que estimulan e inhiben respectivamente la osteoclastogénesis.20

En nuestro trabajo bloqueando la síntesis de PGs con diclofenaco, un fuerte inhibidor tanto de COX 1 como de COX 2 logramos reducir en forma muy marcada la población de osteoclastos por lo que nuestros resultados corroboran de manera indirecta, el papel de las prostaglandinas en la formación de osteoclastos en los sitios de reabsorción ósea en las zonas de presión del periodonto, cuando se aplica una fuerza ortodóncica.

En nuestro modelo, en el que solamente observamos el efecto a las 24, 48 y 72 horas, la inhibición casi total de la formación de osteoclastos nos permite corroborar el efecto primordial de las prostaglandinas en la señalización requerida para estimular a los preosteoclastos locales, para que reconozcan el sitio donde se localizarán en la superficie ósea a reabsorber y en la fusión de los mismos.


Conclusiones
EL AINE diclofenaco, en dosis medias es eficaz para disminuir la población de osteoclastos, en nuestro modelo de estudio.


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